HEMOGLOBINA GLICOSILADA


Su importancia fisiológica se puso de manifiesto a partir del hallazgo de que parte de la hemoglobina en la sangre de individuos sanos está glicosilada y que el nivel de glicosilación es mayor en pacientes diabéticos. La disminución de la actividad biológica como consecuencia de la glicosilación aparece en un reducido número de pacientes, incluyendo varios sistemas enzimáticos donde grupos amino participaron en la catálisis enzimática. En la diabetes la hemoglobina glicosilada y la fructosamina son las determinaciones de laboratorio más frecuentes utilizadas en el control metabólico y su estabilidad, que permite prevenir los efectos nocivos de la hiperglicemia. Por más de 50 años, el avance en la comprensión del mecanismo químico de la glicosilación estuvo estrictamente vinculado con la ciencia y la tecnología alimentaria. Su importancia fisiológica se puso de manifiesto a partir del descubrimiento de que parte de la hemoglobina en la sangre de individuos sanos esta glicosilada y de que el nivel de glicosilación es mayor en pacientes diabéticos. Algunos autores hasta el momento indican entre otros la acumulación de Productos de Glicosilación Avanzada (PGA).Desde el punto de vista químico, la glucosilación se define como la reacción de grupos aminos primarios de aminoácidos, péptidos y proteínas con el grupo carbonilo de los azúcares reductores. A lo largo de esta reacción se pueden distinguir tres etapas: inicialmente se produce la asociación del azúcar con la proteína, formando un compuesto denominado . (http://scielo.sld.cu/img/revistas/amc/v13n6/f0120609.gif). La estructura se reordena hacia una forma más estable, denominada producto de Amadori. La glucosa es el azúcar reductor más abundante en el organismo. Su concentración en la sangre está sometida a un cuidadoso mecanismo de regulación en individuos sanos y, en personas que padecen diabetes, aumenta sustancialmente. Esto conlleva a que sea el azúcar reductor generalmente considerado en las reacciones de glucosilación no enzimática de interés biológico. Sin embargo, cualquier azúcar que posea un grupo carbonilo libre puede reaccionar con los grupos amino primarios de las proteínas para formar bases de Schiff. La reactividad de los distintos azúcares está dada por la disponibilidad de su grupo carbonilo. Se sabe que la forma abierta o extendida de los azúcares no es muy estable, a tal punto que, por ejemplo, en la glucosa representa sólo el 0.002%. De hecho, los azúcares fosfato, que son azúcares reductores de gran importancia en el interior celular, poseen mayor capacidad glicosilante que la glucosa dada su mayor proporción de forma carbonílica (alifática). El sitio de la proteína donde se encuentra cada grupo determina localmente su basicidad (cuanto más básico es un grupo amino más fácilmente reaccionará con el grupo carbonilo de los azúcares); ambos factores (accesibilidad y basicidad), determinan que cuando una proteína reacciona con un azúcar, sólo algunas de las cadenas laterales de sus residuos de lisina y arginina participarán directamente en la reacción.Etapas reversibles del proceso de glucosilación
ondrechen2.jpg
base de schiff
La base de Schiff inicialmente formada cuando reacciona un azúcar reductor con una proteína resulta de la adición del grupo amino de la proteína al grupo carbonilo del azúcar; esta molécula es estable por un corto tiempo, luego del cual se inicia un proceso de reordenamiento de los enlaces químicos, que da lugar a un prodcto más estable denominado genéricamente producto de Amadori. El hecho de que ambas reacciones sean reversibles y consecutivas determina que de acuerdo al tiempo de evolución del sistema, habrá predominio de la base de Schiff (horas) o del producto de Amadori (días). La interrupción del contacto de la glucosa con la proteína en cualquiera de estas etapas produce la reversión completa del efecto. Formación de productos de glicosilación avanzadaLos productos de Amadori poseen un grupo carbonilo que puede seguir reaccionando con otros grupos amino. Durante esta etapa se forman también compuestos altamente reactivos que poseen dos grupos carbonilo y que actúan como propagadores de la reacción. Luego de varios meses o inclusive años de contacto con la glucosa, las proteínas de bajo recambio (vida media larga como colágeno), originan los productos de glicosilación avanzada. A diferencia de la formación de la base de Schiff o del producto de Amadori (reversibles) la formación de "PGA" es un proceso lento e irreversible. Las proteínas modificadas por los PGA pueden encontrarse en el plasma, en el compartimiento intracelular así como en la matriz extracelular.La Hemoglobina Glicosilada (Hb A1c)
000.png
Hemoglobina glicosilada
Actualmente, el control metabólico no se valora solamente por el control glucémico, sino que hay otra serie de parámetros, como las denominadas proteínas glicosiladas, entre las que destaca la Hemoglobina Glicosilada (Hb A 1c), que indican fielmente el grado de control que, a largo plazo, ha mantenido el diabético.
La hemoglobina glicosilada es una fracción de la hemoglobina A normal del adulto, que tiene la propiedad de unir, de forma irreversible, cantidades de Glucosa proporcionales a la concentración glicémica. Al conjunto de todas ellas se les denomina Hemoglobina A 1 o Hemoglobina glicosilada, pero, a su vez, dentro de la Hemoglobina A 1 se pueden separar varias fracciones, que se diferencian por los diferentes azúcares a los que van unidos, siendo la de mayor interés y la que se encuentra en un porcentaje más elevado la Hb A 1c, que es la que se encuentra unida a la Glucosa. Entre los factores que condicionan la intensidad de la glicosilación se destacan:
- La concentración (cantidad) de Glucosa sanguínea. - El tiempo durante el que se mantiene esa cantidad de Glucosa. - La vida media (tiempo que tarda en destruirse) de la proteína glicosilada. - En el caso de la Hemoglobina, y teniendo en cuenta que la vida media del glóbulo rojo es aproximadamente de 120 días, su determinación nos servirá para evaluar el control de las cifras medias de Glucosa en sangre que ha mantenido un diabético durante los 2 a 3 meses precedentes a la realización del análisis. - Falsos descensos de la Hb A 1c Se pueden presentar en aquellos trastornos y situaciones en los que se altera la vida media de los glóbulos rojos, como en el caso del embarazo, en algunos tipos de anemias y de transfusiones recientes.
Métodos de diagnóstico:1600dr.jpg
- Inmunoturbidimetria (inmunológica):Son métodos basados en reacciones inmunológicas, que poseen una gran similitud técnica con la espectrofotometría de absorción molecular, en cuanto a integrarse dentro del mismo autoanalizador. Consisten, en concreto, en la valoración de la disminución de la potencia radiante, de una emisión policromática, al atravesar una solución de partículas (inmunocomplejos), medida en la misma dirección en que es emitida (es decir, el emisor y el detector están a 0º). Dicha disminución es debida a procesos de absorción, dispersión y reflexión. En función del momento de la reacción en que se realizan las medidas de disminución de la radiación, podemos distinguir dos tipos :
Inmunoturbidimetría a punto final: se realizan únicamente dos medidas, una al principio de la reacción y otra a tiempo prefijado en la zona de equilibrio de la misma.
Inmunoturbidimetría cinética: se realiza una lectura múltiple (mínimo 2 puntos) a lo largo de la reacción inmunológica, valorando la velocidad de formación de inmunocomplejos.
- Cromatografía de Intercambio catiónico
intercambio.jpgProceso que permite la separación de iones y moléculas polares basado en las propiedades de carga de las moléculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo de molécula cargada, incluyendo grandes proteínas, pequeños nucleótidos y aminoácidos. La solución que debe inyectarse es usualmente llamada "muestra" y los componentes separados individualmente son llamados analitos. La cromatografía de intercambio catiónico separa las proteínas de acuerdo a su carga neta. Ajustando el pH o la concentración de aniones de la fase móvil las proteínas pueden separarse. Como técnica típica tenemos la introducción de una muestra de forma manual dentro de un ciclo de muestras de volumen conocido; una solución buffer acuosa (fase móvil del bucle a la columna) que contiene alguna forma de material en fase estacionaria, que es típicamente una resina o matriz de gel (agarosa o celulosa unido a grupos funcionales cargados). Los analitos objetivo (en este caso positivos) son conservados en la fase estacionaria pero pueden ser eliminados incrementando la concentración de especies de similar carga que pueden desplazar los aniones de la fase estacionarias, siendo visualizados por conductividad o por absorción de luz UV/Visible.
- Concentración isoeléctrica
citometria_flujo8.pngEl citómetro de flujo es una técnica para contar, examinar y clasificar las partículas microscópicas suspendidas en una corriente de líquido. Permite el análisis multiparamétrico simultáneo de las características físicas y/o químicas de las células que atraviesan un aparato óptico y/o electrónico de detección. Los citómetros de flujo modernos pueden analizar varios miles de partículas cada segundo en “tiempo real” y pueden separar y aislar activamente las partículas con características específicas. Un citómetro del flujo es similar a un microscopio, pero la citrometría de flujo ofrece una cuantificación automatizada de “procesamiento de alto-rendimiento” (para una gran cantidad de células) según un sistema de parámetros.

Pueden utilizarse un exceso de dos anticuerpos monoclonales antígeno-específicos que reconozcan un antígeno en diversos dominios. El primer anticuerpo se inmoviliza en la superficie interna de un tubo. El anticuerpo secundario se marca con luminescencia y se utiliza en común para ambos ensayos. La luminiscencia es detectada usando un luminómetro automático. También se usa la espectroscopía de fluorescencia, también llamada fluorometría o espectrofluorimetría, que es un tipo de espectroscopía electromagnética que analiza la fluorescencia de una muestra. Los electrones de una molécula son excitados por un haz de luz que generalmente es luz ultravioleta. Esto causa la emisión de luz en una energía más baja, pero no necesariamente luz visible. Una técnica complementaria es la espectroscopia de absorción. Los dispositivos que miden fluorescencia se llaman los fluorómetros o fluorímetros.

- Electroforesis
electroforesis.jpgSeparación de proteínas mediante la aplicación de un campo eléctrico. Posee diversas técinas:
Electroforesis de zona: las proteínas son moléculas anfóteras. Normalmente, la separación electroforética de proteínas se hace a pH alcalino, en el que la mayoría de las proteínas presentan una carga global negativa (básicamente se usa en la detección de variantes de la hemoglobina). La muestra se inserta en un medio de soporte y se aplica una diferencia de potencial durante un tiempo determinado para separar las proteínas. Cada proteína migrará en función de su carga. A mayor carga y menor tamaño, más velocidad de migración.
hemoglobinelectrophoresis.jpgIsoelectroenfoque: se separan en función de su punto isoeléctrico (pI), se crea un gradiente de pH mediante anfolitos (estabilizan el pH a lo largo del gel). Cada proteína migrará hasta alcanzar su pI, punto en el cual precipitará al acumularse.
Separación por tamaño: permite separar proteínas que deben ser tratadas con SDS (sodio dodecil sulfato) para que su carga sea negativa y todas migren hacia el ánodo; una vez separadas las proteínas, deben fijarse y teñirse para poder ser visualizadas.
El proceso de electroforesis aprovecha el hecho de que las hemoglobinas tienen diferentes cargas eléctricas; se le coloca en una corriente eléctrica que pasa a través de la hemoglobina en la muestra de sangre, lo cual hace que los tipos de hemoglobina se separen en diferentes momentos y formen bandas según el tamaño de sus moléculas; siendo comparadas la forma en la que se separan con la de una muestra de sangre normal.- Colorimetría (ácido tiobarbitúrico)color.jpgEl procedimiento consiste sustancialmente en sumar la respuesta de estimulos de colores y su normalización a la curva espectral de respuesta del fotorreceptor sensible al color. Como referencia, se utiliza la curva espectral codificada de la Comisión Internacional de Iluminación, (conocida por sus siglas CIE en francés), la llamada función colorimétrica. La saturación de un color es su grado de pureza. Un color está más saturado cuanto menor sea su contenido de grises o de blancos. La intensidad, o luminosidad de un color, es la característica que hace que este aparezca más claro, independientemente de su saturación.
- HPLC (Cromatografía líquida de alta peroformance), técnica de referencia para NGSP (Nacional Glycohemoglobin Standadization Program).columna.jpgTécnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica. Existen de diversos tipos:Cromatografía de fase normal: separa los compuestos en base a su polaridad. La fuerza de absorción aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interacción entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar aumenta el tiempo de retención.
Cromatografía de fase reversa: posee una fase estacionaria apolar y una fase móvil de polaridad moderada. El tiempo de retención es mayor para las moléculas apolares, mientras que las moléculas polares eluyen más rápidamente. La fuerza conductora en la unión del compuesto a la fase estacionaria es la disminución del área del segmento apolar del analito expuesto al disolvente. Este efecto hidrofóbico está dominado por la disminución de la energía libre de la entropía asociada con la minimización de la interfase compuesto-disolvente polar. Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la hidrofobicidad del compuesto (la mayoría de métodos utilizan un tampón).
Cromatografía de exclusión molecular: también conocida como cromatografía por filtración en gel, separa las partículas de la muestra en función de su tamaño; la fase estacionaria consiste en largos polímeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa, quedando conectados formando una malla o red.
Cromatografía de intercambio iónico: atracción electrostática entre los iones en solución y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria. Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna.
Cromatografía basada en bioafinidad: capacidad de las sustancias biológicamente activas de formar complejos estables, específicos y reversibles que implica la participación de fuerzas moleculares como las interacciones de Van der Waals, interacciones electrostáticas, interacciones dipolo-dipolo, interacción hidrofóbicas y puentes de hidrógeno entre las partículas de la muestra y la fase estacionaria.
Valores de la hemoglobina glicosilada

cardback_grande.jpg

LÍPIDOS

Para las determinaciones de lípidos en plasma es conveniente que el paciente lleve el estilo de vida cotidiano los días previos a la extracción, no modifique su dieta habitual, y que el peso esté estable durante 2-3 semanas antes de la extracción; además se debe evitar el ejercicio físico intenso durante las horas previas a la extracción, ayunar durante 10-15 horas y suspender tratamientos. LDL_colesterol_(colesterol_livre).jpg* Determinación de la concentración de colesterol. El colesterol es uno de los lípidos más importantes (forma parte de la membrana plasmática, es esencial para el crecimiento y viabilidad celular). Se trata de una molécula que sólo es peligrosa cuando se encuentra en exceso en la sangre, normalmente por ingesta excesiva o no balanceada de grasas animales y se ve incrementando dicho riesgo en individuos sedentarios. Para poder circular en sangre, el colesterol se combina con LDL, siendo identificable gracias a ésta. Existen métodos tanto de tipo químico como enzimáticos, os químicos determinan el colesterol colorimétricamente; se han sustituido casi por completo por métodos enzimáticos, que determinan la concentración de colesterol total directamente en plasma en que se hidrolizan los ésteres de colesterol, se oxida el colesterol y el agua oxigenada resultante se determina enzimáticamente.

trigliceridos2.gif
TAG
* Determinación de la concentración de triglicéridos
. Los triglicéridos (TAG) se acumulan principalmente en adipocitos y constituyen un depósito de combustible metabólico. Para su determinación se utilizan métodos químicos y enzimáticos:

- Métodos químicos: se extraen los TAG y otros lípidos con disolventes orgánicos, después se aíslan los TAG y finalmente se hidrolizan a glicerol y ácidos grasos. El glicerol obtenido es oxidado a formaldehído, que puede ser determinado por diferentes métodos utilizando sustratos especiales para metabolismo lipídicos o tinciones especiales.- Métodos enzimáticos: Se hidrolizan los TAG de la muestra y el glicerol que se obtiene es sometido a una serie de reacciones enzimáticas acopladas, en las que se forma nicotinamida adenina di nucleótido fosfato (NADP), que se puede medir por espectrofotometría.


lipoproteina.jpg
lipoproteína
* Determinación de la concentración de lipoproteínas
. En los casos en que existe un exceso de colesterol (hipercolesterolemia) o de triglicéridos (hipertrigliceridemia), se realiza un análisis de las lipoproteínas (requieren una etapa previa de separación). Existen diferentes métodos de separación:
- Por ultracentrifugación: permite separar las diferentes familias de lipoproteínas en base a sus densidades. Está basada en dos propiedades, una es la baja densidad que tienen las lipoproteínas respecto a otras macromoléculas plasmáticas y otra es que cada tipo de lipoproteína tiene una densidad diferente (método empleado con frecuencia).- Por precipitación: Las proteínas precipitan en presencia de polianiones como el sulfato de heparina o en presencia de cationes divalentes (Ca+2, Mg+2, y Mn+2) que está influida por varios factores para que las principales proteínas precipiten escalonadamente, empezando por las de menor densidad.

* Determinación de la concentración de fosfolípidos. Los fosfolípidos son otro componente de las membranas plasmáticas, se determina su presencia en sangre por métodos químicos y enzimáticos.; siendo los primeros basados en la determinación del contenido de fósforo de los fosfolípidos; los segundos se basan en la hidrólisis de los fosfolípidos y en la posterior determinación de algún producto de la reacción (glicerol, fosfato, ácidos grasos, etc.)

membra8.jpg
Fosfolípidos




Referencias bibliográficas:
http://www.portalesmedicos.com/publicaciones/articles/1620/1/Frecuencia-de-valores-elevados-de-hemoglobina-glicosilada-HbA1c-en-muestra-aleatoria-de-donantes-de-sangre-neoespartanos.html
http://www.medicinapreventiva.com.ve/laboratorio/A1c.htm
http://www.tuotromedico.com/temas/hemoglobina_glicosilada.htm
http://www.estudiabetes.org/forum/topics/hemoglobina-glucosilada-que-es


http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003640.htm
www.wikipedia.es